Hur fungerar Western Blotting?

Western blotting är en teknik i molekylärbiologi som används vid detektering av ett specifikt protein i ett prov. Det använder SDS-PAGE för att separera proteiner baserat på deras storlek och dessa separerade proteiner överförs sedan till ett membran. Denna teknik använder specifika primära antikroppar i märkningen av ett visst protein i blottet. Sekundära antikroppar som är märkta med reporterproteiner detekterar de labled proteinerna med den primära antikroppen.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är Western Blotting
     - Definition, fakta, tillämpningar
2. Hur fungerar Western Blotting?
     - Process av Western Blotting

Viktiga villkor: Färgutveckling, nitrocellulosamembran, primär antikropp, sekundär antikropp, västblottning

Vad är Western Blotting

Western blotting är en hybridiseringsteknik som används vid detektering av ett visst protein i ett prov. Det kallas också immunoblottning eftersom tekniken använder antikroppar för både märkning av proteinet av intresse och detektering av antikroppmärkt proteiner.

Figur 1: Western Blot

Western blotting utvecklades först av Towbin 1979 och används för närvarande som en rutinteknik för proteinanalys. 

Hur fungerar Western Blotting?

Western blotting används huvudsakligen vid detektering av ett specifikt protein i ett prov. Stegen i Western Blotting-tekniken beskrivs nedan.

1. SDS-PAGE - Proteinprovet separeras baserat på deras storlek genom SDS-PAGE.
2. Överföring av proteiner till ett membran - De storleksfraktionerade proteinerna överförs till antingen ett nitrocellulosa eller polyvinyliden-difluorid-membran (PVDF). De tekniker som är inblandade i denna överföring är diffusionsöverföring.
3. Blockering av icke-specifika webbplatser - De obebodda ställena på membranet blockeras för att förhindra icke-specifik bindning av proteiner. Fettfri torrmjölk eller bovint serumalbumin (BSA) kan användas för detta ändamål.
4. Primär antikroppsinkubation - Det blockerade membranet inkuberas med en primär antikroppslösning. Dessa primära antikroppar binder till ett visst protein på membranet.
5. Sekundär antikropp inkubation - Membranet inkuberas med sekundära antikroppar, som binder till de primära antikropparna. Sekundära antikroppar är konjugerade till reporterproteiner. Dessa reporterproteiner kan vara biotin, alkaliskt fosfatas eller pepparrotperoxidas.
6. Proteindetektion genom färgutveckling - De konjugerade enzymreporterna reagerar med deras substrat för att alstra ett färgat alkaliskt fosfatas omvandlar BCIP till en blå färgprodukt medan pepparrotperoxidas omvandlar luminol, avgivande luminesce.

Figur 2: Western Blotting - Procedure

Slutsats

Western blotting är en hybridiseringsteknik som används vid detektering av närvaron av ett visst protein i ett prov. Det använder SDS-PAGE för att separera proteiner baserat på deras storlek och bindning med primära antikroppar, vilka kan kännas igen av sekundära antikroppar under färgutveckling.

Referens:

1. "Western Blotting Fundamental Princip, How Western Blots Work." Boster, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Anti-lipoic acid immunoblot" Av TimVickers - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
2. "Western Blotting" av Cawang - eget arbete, CC0) via Commons Wikimedia