Hur man gör stabil transfekterad celllinje

Stabil transfektion är den långsiktiga introduktionen av främmande DNA i celler. Stabilt transfekterade celler passerar det främmande DNA genom avkomma. Därför, för att skapa stabilt transfekterade cellinjer måste främmande DNA integreras i cellens genom. Stabil arv kan dock observeras i nongenomisk DNA. En framgångsrik, stabil transfektion kräver effektiva metoder för DNA-leverans såväl som urvalsmetoder för främmande DNA inom cellinjen. Stabilt transfekterade cellinjer används för ett brett användningsområde, såsom produktion av rekombinanta proteiner, genfunktionsstudier, läkemedelsupptäckningsanalyser, etc.

Viktiga områden som omfattas

1. Hur man gör stabil transfekterad celllinje
      - Stabil Cell Line Generation Protocol
2. Så här väljer du Transfekterad DNA i Cell Line
     - Urval av stabilt transfekterad cellinje

Nyckelvillkor: Episomalt underhåll, integration i genomet, plasmid, urval, stabilt transfekterade celllinjer

Hur man gör stabil transfekterad celllinje

Transfektion är en metod för genöverföring där det genetiska materialet avsiktligt införs i värdcellen med kemiska eller icke-kemiska metoder. Det finns två typer av stabilt transfekterade cellinjer:

1. Den huvudsakliga typen stabila cellinjer genereras genom direkt integration av transfekterat DNA i värdorganismernas genom. Transfekterat DNA integreras i genomet genom homolog rekombination.
2. Den andra metoden för att generera stabila cellinjer är det episomala underhållet av det transfekterade DNA. Eukaryotiska vektorer används vid transfektion av DNA som inte är integrerade i genomet. Stabiliteten hos episomal DNA är dock låg. Även episoder upprätthålls endast av vissa typer av arter. Stabilt transfekterade cellinjer visas i Figur 1.

Figur 1: stabilt transfekterade celllinjer

Bearbeta

Stegen involverade i framställning av stabila cellinjer beskrivs nedan.

1. Generering av en dödskurva som bestämmer det optimala urvalet av antibiotikakoncentrationen - Celler utsätts för ökande mängder antibiotikakoncentration för att bestämma den minsta antibiotikakoncentration som krävs för att döda alla celler över en vecka.
2. Transfektion av celler med önskad plasmidkonstruktion - Metoden för transfektion skiljer sig från typen av värdceller. Liposomreagenser används vid transfektion av vidhäftande cellinjer. Elektrotransfektion eller virala metoder används för att transfektera suspensionscellinjer.
3. Välj och expandera stabila polyklonala kolonier - Vid 48-72 timmar transfektion tillsätts höga, optimala och låga koncentrationer av selektiva antibiotika till odlingarna för att erhålla de stabilt transfekterade cellinjerna.

Så här väljer du Transfekterad DNA i celllinjer

Urvalsmarkörer uttrycks tillsammans med det transfekterade DNA för valet av framgångsrikt transfekterade celler. Markörgenen kan vara i samma vektor (cis) som används för att transfektera värdcellen eller på en annan vektor (trans). Motståndet mot antibiotika, såsom neomycin, zeocin, hygromycin, puromycin, DHFR, etc. kan användas vid urvalet. Dessutom kan transfekterade gener märkas med GFP.

Slutsats

Stabila cellinjer kan huvudsakligen framställas genom att integrera transfekterat DNA i genomet. Vidare kan episomalt underhåll av transfekterat DNA också användas för att göra stabila cellinjer under en lång tidsperiod i vissa värdorganismer. En urvalsmetod bör finnas för identifiering av transfekterat DNA i cellinjen. 

Referens:

1. "Protokoll av stabil cellcellsgenerering". Creative BioMart, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Knockout musproduktion 2" Av Kjaergaard - Egent arbete (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia